细胞组织块培养法

    一、目的

    学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的培养。

    二、概述

    组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法?？梢圆捎眉羟蟹?，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例）

    三、材料

    （一）仪器

    1.净化工作台

    2.恒温水浴箱

    3.冰箱（4℃、-20℃）

    4.倒置相差显微镜

    5.培养箱

    （二）玻璃器皿

    1.培养皿（Φ100mm）

    2.吸管（弯头）

    3.烧杯（500ml、200ml、10ml）

    4.广口试剂瓶（500ml）

    5.玻璃瓶（250ml、100ml）

    6.培养瓶

    7.废液缸

 
    （三）塑料器皿

    1.吸头

    2.枪头

    3.胶塞

    4.EP管

    （四）其他物品

    1.微量加样枪

    2.眼科组织剪（直尖、弯）

    3.眼科组织镊（直、弯）

    4.12.5cm组织镊（无钩、1×2钩）

    5.25cm敷料镊（无钩）

    6.止血钳（18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式）

    7.解剖剪

    （五）试剂

    1.D-Hanks液

    2.小牛血清

    3.RPMI1640

    4.双抗（青霉素、链霉素）

    5.1N HCl

    6. 7.4%NaHCO3

    四、操作步骤

    1.取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的D-Hanks液中漂洗。                                                                                                                               
    2.组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗主动脉3次，除去血kuai及杂组织等。

    3.平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清RPMI1640漂洗3次。

    4.剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。

    5.贴块：将剪切好的组织小块，用眼科镊送入培养瓶内，用弯头吸管将组织块均匀摆置，每小块间距0.5cm左右，组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量含10%牛血清培养液，盖好瓶盖。

    6.培养：将培养瓶瓶底朝上，37℃培养箱放置2～4h，待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。

    7.换液：原代培养3～5d，需换液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞。   

    组织块培养法也可不用翻转法，即在摆放组织块后，向培养瓶内仅加入少量培养液，以能保持组织块湿润即可，盖好瓶盖，放置37℃培养箱24h再补加培养液。

    注意事项

    1.取材的组织尽快培养。因故不能即时培养，可将组织浸泡于培养液内，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果组织块很大，应切成1cm3以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。

    2.从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材，可用含500～1000u/ml的青、链霉素BSS液漂洗5～10min，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。

    3.组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂薄层血清、胎汁或鼠尾胶等。

    4.原代培养的1～2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除。